FIOCRUZ-BA PVM:
considerações de QC para Illumina MiSeq
M.Sc. Laise de Moraes
2021
Illumina Sequencing Analysis Viewer (SAV)
ARQUIVOS REQUERIDOS
Métricas de qualidade:
- Q30
- CD (Cluster Density) - K/mm²
- PF (Passing Filter)
- Phasing/Pre-Phasing
- FWHM (Full Width Half Mass)
- Intensidade
- Imaging
Q score
Escala PHRED de qualidade que representa a probabilidade estimada de um erro ocorrer na chamada de bases.
/
| PHRED | Probabilidade de chamada de base incorreta | Acurácia da chamada de base (%) |
|---|---|---|
| 3 | 1 em 2 | 50,00 |
| 7 | 1 em 5,01 | 80,05 |
| 8 | 1 em 6,31 | 84,15 |
| 9 | 1 em 7,94 | 87,41 |
| 10 | 1 em 10 | 90,00 |
| 20 | 1 em 100 | 99,00 |
| 30 | 1 em 1.000 | 99,90 |
| 40 | 1 em 10.000 | 99,99 |
| 50 | 1 em 100.000 | 99,999 |
| 60 | 1 em 1.000.000 | 99,9999 |
Q score
Escala PHRED de qualidade que representa a probabilidade estimada de um erro ocorrer na chamada de bases.
/
| PHRED | Probabilidade de chamada de base incorreta | Acurácia da chamada de base (%) |
|---|---|---|
| 3 | 1 em 2 | 50,00 |
| 7 | 1 em 5,01 | 80,05 |
| 8 | 1 em 6,31 | 84,15 |
| 9 | 1 em 7,94 | 87,41 |
| 10 | 1 em 10 | 90,00 |
| 20 | 1 em 100 | 99,00 |
| 30 | 1 em 1.000 | 99,90 |
| 40 | 1 em 10.000 | 99,99 |
| 50 | 1 em 100.000 | 99,999 |
| 60 | 1 em 1.000.000 | 99,9999 |
Perdas maiores = problemas na preparação da biblioteca ou nos reagentes.
Q score
Perda normal
| Kit | Q30 (%) |
|---|---|
| 600-V3 | >=70 |
| 150-V3 | >=85 |
| 500-V2 | >=75 |
| 300-V2 | >=80 |
É normal haver uma perda em Q30 da Read1 para Read4.
CD (K/mm²) e %PF
Baixa densidade pode ocorrer devido à preparação da biblioteca:
- Desnaturação ruim
- Tamanho incorreto do fragmento*
- Quantificação inadequada*
Alta densidade também pode ocasionar problemas:
- Muito material carregado na flowcell
- Tamanho incorreto do fragmento*
- Quantificação inadequada*
CD e %PF são inversamente proporcionais:
- %PF ideal é acima de 80
- Baixo %PF pode ocasionar em perda de cobertura para algumas amostras
- Mudanças na relação pode ocorrer por problema no sequenciador ou reagentes
| Kit | CD (K/mm²) |
|---|---|
| 600-V3 | 1200-1400 |
| 500-V2 | 600-1200 |
| 300-V2 | 600-1200 |
/
Phasing/Pre-Phasing
Phasing = a molécula está ficando "para trás"
Pre-Phasing = a molécula está ficando "à frente"
Valores acima de 0,25 significa que 0,25% das moléculas estão fora de sincronismo
Problemas no sequenciador ou reagentes:
- Reagentes com expirados, lote com problema ou manuseio inadequado;
- Problema de fluidos, temperatura inadequada no sequenciador.
Taxa na qual as moléculas no cluster perdem a sincronização uma com as outras.
/
FWHM
Data By Cycle > FWHM
Problemas na preparação da biblioteca:
- >3.5: fragmentos muito longos
- <2.0: fragmentos muito curtos
Problemas no sequenciador:
- Observar se há picos irregulares no plot
Avalia a massa e tamanho dos fragmentos e deve estar entre 2 e 3.5
/
Intensidade
Data By Cycle > Intensity
Problemas na preparação da biblioteca ou sequenciador:
- Picos irregulares
A intensidade geral da corrida deve estar acima de 90
Captação da imagem
As imagens podem ajudar a identificar problemas de formação de cluster
Problemas na captação da imagem