Técnicas moleculares aplicadas à HTLV

MSc. Laise de Moraes

2020

Componentes

Reação em Cadeira da Polimerase (PCR) -- Princípio e Componentes

Gerar múltiplas cópias de uma sequência específica de nucleotídeos de um determinado organismo, com alta sensibilidade e especificidade.

Princípio

  • Água livre de nucleases
  • Solução tampão
  • Nucleotídeos ---> dNTPs
  • Mg2+
  • Enzima DNA polimerase
  • Par de iniciadores ---> primers
  • Amostra de DNA

Componentes

  • Água livre de nucleases
  • Solução tampão
  • Nucleotídeos ---> dNTPs
  • Mg2+
  • Enzima DNA polimerase
  • Par de iniciadores ---> primers
  • Amostra de DNA

Gerar múltiplas cópias de uma sequência específica de nucleotídeos de um determinado organismo, com alta sensibilidade e especificidade.

Princípio

Reação em Cadeira da Polimerase (PCR) -- Princípio e Componentes
PCR Convencional -- Ciclagem e Amplificação Exponencial

desnaturação inicial

desnaturação

pareamento

extensão

extensão final

hold

~94°C

~94°C

~52°C

~72°C

~72°C

4°C

30-40 ciclos

~24°C

início

~3 minutos

~1 minuto

~30 segundos

~1 minuto

~10 minutos

1.073.741.842
Após 30 ciclos

Separação da dupla fita de DNA

Polimerização da fita complementar

Ligação do primer ao DNA

1.073.741.842
Após 30 ciclos

desnaturação inicial

desnaturação

pareamento

extensão

extensão final

hold

~94°C

~94°C

~52°C

~72°C

~72°C

4°C

30-40 ciclos

~24°C

início

~3 minutos

~1 minuto

~30 segundos

~1 minuto

~10 minutos

Separação da dupla fita de DNA

Polimerização da fita complementar

Ligação do primer ao DNA

PCR Convencional -- Ciclagem e Amplificação Exponencial

amostra + loading dye

gel

tampão

cátodo

ânodo

DNA possui carga negativa

Migração do polo negativa (cátodo) para o polo positivo (ânodo)

O tamanho da molécula é proporcional à velocidade de migração

Após revelação do gel...

DNA

PCR Convencional -- Visualização em Gel de Agarose

amostra

gel

tampão

cátodo

ânodo

DNA

DNA possui carga negativa

Migração do polo negativa (cátodo) para o polo positivo (ânodo)

O tamanho da molécula é proporcional à velocidade de migração

Após revelação do gel...
PCR Convencional -- Visualização em Gel de Agarose
  • PCR modificada para reduzir produtos não específicos.
  • Detecção de material em baixa quantidade na amostra.
  • 2 rounds de reação com diferentes pares de primers.

Nested PCR

3'

5'

3'

5'

1º round com par de primers externos

3'

5'

3'

5'

2º round com par de primers internos

Variantes da PCR -- Nested PCR
  • Produto específico e com maior concentração.

2° round

  • Produto inespecífico.

1° round

  • PCR modificada para reduzir produtos não específicos.
  • Detecção de material em baixa quantidade na amostra.
  • 2 rounds de reação com diferentes pares de primers.

Nested PCR

  • Produto específico e com maior concentração.

2° round

  • Produto inespecífico.

1° round

3'

5'

3'

5'

1º round com par de primers externos

3'

5'

3'

5'

2º round com par de primers internos

Variantes da PCR -- Nested PCR
  • Transcrição de RNA em DNA complementar (cDNA).
  • Utiliza RNA de fita simples como molde para sintetizar DNA de  fita dupla.

RT-PCR

Associação da RT-PCR e PCR em uma só etapa

One-Step PCR

AAA    RNA

AAA    cDNA

primer

fita complementar

Transcrição reversa

Variantes da PCR -- RT-PCR e One-Step PCR
  • Transcrição de RNA em DNA complementar (cDNA).
  • Utiliza RNA de fita simples como molde para sintetizar DNA de  fita dupla.

RT-PCR

Associação da RT-PCR e PCR em uma só etapa

One-Step PCR

AAA    RNA

AAA    cDNA

primer

fita complementar

Transcrição reversa

Variantes da PCR -- RT-PCR e One-Step PCR
  • Transcrição de RNA em DNA complementar (cDNA).
  • Utiliza RNA de fita simples como molde para sintetizar DNA de  fita dupla.

RT-PCR

Associação da RT-PCR e PCR em uma só etapa

One-Step PCR

AAA    RNA

AAA    cDNA

primer

fita complementar

Transcrição reversa

Variantes da PCR -- RT-PCR e One-Step PCR
  • PCR + sistema de detecção de fluorescência em tempo real.
  • Detecção, quantificação e amplificação em uma única etapa.

PCR quantitativo (qPCR)

Componentes

  • Água livre de nucleases
  • Solução tampão
  • Nucleotídeos ---> dNTPs
  • Mg2+
  • Enzima DNA polimerase
  • Par de iniciadores ---> primers
  • Amostra de DNA

+

SONDA (PROBE) COM FLUORESCÊNCIA

Oligonucleotídeo marcado

CORANTE FLUORESCENTE

Intercalante de DNA de dupla fita

OU

Variantes da PCR -- qPCR
  • PCR + sistema de detecção de fluorescência em tempo real.
  • Detecção, quantificação e amplificação em uma única etapa.

qPCR

Componentes

  • Água livre de nucleases
  • Solução tampão
  • Nucleotídeos ---> dNTPs
  • Mg2+
  • Enzima DNA polimerase
  • Par de iniciadores ---> primers
  • Amostra de DNA

+

SONDA (PROBE) COM FLUORESCÊNCIA

Oligonucleotídeo marcado

CORANTE FLUORESCENTE

Intercalante de DNA de dupla fita

OU

Variantes da PCR -- qPCR
  • Detecção não específica.
  • Fluoróforo liga-se à DNA dupla fita e emite fluorescência.

Corante fluorescente - intercalante de DNA de dupla fita

F

F

F

F

Desnaturação

SYBR Green

F

F

F

Taq

Hibridização

Emissão de fluorescência

F

F

Taq

Extensão

Emissão de fluorescência

F

F

F

  • Emite fluorescência na presença do produto de PCR de interesse.
  • QUENCHER e REPORTER na mesma molécula: transferência de energia.
  • Permite multiplex.

Sonda (probe) - oligonucleotídeo marcado

5'

3'

5'

5'

3'

5'

Q

R

5'

3'

5'

5'

3'

5'

Q

R

Emissão de fluorescência

Variantes da PCR -- qPCR
  • Detecção não específica.
  • Fluoróforo liga-se à DNA dupla fita e emite fluorescência.

Corante fluorescente - intercalante de DNA de dupla fita

  • Emite fluorescência na presença do produto de PCR de interesse.
  • QUENCHER e REPORTER na mesma molécula: transferência de energia.
  • Permite multiplex.

Sonda (probe) - oligonucleotídeo marcado

5'

3'

5'

5'

3'

5'

Q

R

5'

3'

5'

5'

3'

5'

Q

R

Emissão de fluorescência

F

F

F

F

Desnaturação

SYBR Green

F

F

F

Taq

Hibridização

Emissão de fluorescência

F

F

Taq

Extensão

Emissão de fluorescência

F

F

F

Variantes da PCR -- qPCR
Variantes da PCR -- qPCR

Threshold

CT - ciclo onde a reação cruza o limiar de detecção (THRESHOLD)

Aquisição dos dados
Ciclagem
Variantes da PCR -- qPCR

Threshold

CT - ciclo onde a reação cruza o limiar de detecção (THRESHOLD)

Aquisição dos dados
Ciclagem
Variantes da PCR -- qPCR
Quantificação relativa
Quantificação absoluta
Uso de gene referência para determinar a concentração dos genes alvo
  1. Ct dos genes;
  2. ΔCt = subtração entre o Ct do gene e Ct da referência;
  3. ΔΔCt = subtração entre ΔCt do grupo de estudo e ΔCt do grupo controle;
  4. 2^-(ΔΔCt) = 2 elevado ao negativo de ΔΔCt 
Uso de curva padrão com concentrações conhecidas
Variantes da PCR -- qPCR
Quantificação relativa
Quantificação absoluta
Uso de gene referência para determinar a concentração dos genes alvo
  1. Ct dos genes;
  2. ΔCt = subtração entre o Ct do gene e Ct da referência;
  3. ΔΔCt = subtração entre ΔCt do grupo de estudo e ΔCt do grupo controle;
  4. 2^-(ΔΔCt) = 2 elevado ao negativo de ΔΔCt 
Uso de curva padrão com concentrações conhecidas

Multiplex qPCR

  • PCR + sistema de detecção de fluorescência em tempo real.
  • Detecção, quantificação e amplificação em uma única etapa.
Variantes da PCR -- Multiplex qPCR
Aplicações para o diagnóstico e estudo do HTLV

qPCR para carga proviral

One-Step PCR
Sequenciamento Sanger
Sequenciamento Sanger
Sequenciamento NGS -- MinION
Filtragem das sequências de boa qualidade

Separação das amostras de acordo com "código de barras"

Sequenciamento

Detecção do sinal em picograma

Aplicações para o diagnóstico e estudo do HTLV

Sequenciamento do HTLV

RT-PCR

PCR com primers externos

PCR com primers internos

One-Step PCR

Nested PCR

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