Técnicas Moleculares aplicadas à HTLV

Componentes

Reação em Cadeira da Polimerase (PCR) -- Princípio e Componentes

Gerar múltiplas cópias de uma sequência específica de nucleotídeos de um determinado organismo, com alta sensibilidade e especificidade.

Princípio

Água livre de nucleases
Solução tampão
Nucleotídeos ---> dNTPs
Mg2+
Enzima DNA polimerase
Par de iniciadores ---> primers
Amostra de DNA

Componentes

Água livre de nucleases
Solução tampão
Nucleotídeos ---> dNTPs
Mg2+
Enzima DNA polimerase
Par de iniciadores ---> primers
Amostra de DNA

Gerar múltiplas cópias de uma sequência específica de nucleotídeos de um determinado organismo, com alta sensibilidade e especificidade.

Princípio

Reação em Cadeira da Polimerase (PCR) -- Princípio e Componentes

PCR Convencional -- Ciclagem e Amplificação Exponencial

desnaturação inicial

desnaturação

pareamento

extensão

extensão final

hold

~94°C

~52°C

~72°C

4°C

30-40 ciclos

~24°C

início

~3 minutos

~1 minuto

~30 segundos

~1 minuto

~10 minutos

1.073.741.842

Após 30 ciclos

Separação da dupla fita de DNA

Polimerização da fita complementar

Ligação do primer ao DNA

1.073.741.842

Após 30 ciclos

desnaturação inicial

desnaturação

pareamento

extensão

extensão final

hold

~94°C

~52°C

~72°C

4°C

30-40 ciclos

~24°C

início

~3 minutos

~1 minuto

~30 segundos

~1 minuto

~10 minutos

Separação da dupla fita de DNA

Polimerização da fita complementar

Ligação do primer ao DNA

PCR Convencional -- Ciclagem e Amplificação Exponencial

amostra + loading dye

gel

tampão

cátodo

ânodo

DNA possui carga negativa

Migração do polo negativa (cátodo) para o polo positivo (ânodo)

O tamanho da molécula é proporcional à velocidade de migração

Após revelação do gel...

DNA

PCR Convencional -- Visualização em Gel de Agarose

amostra

gel

tampão

cátodo

ânodo

DNA

DNA possui carga negativa

Migração do polo negativa (cátodo) para o polo positivo (ânodo)

O tamanho da molécula é proporcional à velocidade de migração

Após revelação do gel...

PCR Convencional -- Visualização em Gel de Agarose

PCR modificada para reduzir produtos não específicos.
Detecção de material em baixa quantidade na amostra.
2 rounds de reação com diferentes pares de primers.

Nested PCR

3'

5'

3'

5'

1º round com par de primers externos

3'

5'

3'

5'

2º round com par de primers internos

Variantes da PCR -- Nested PCR

Produto específico e com maior concentração.

2° round

Produto inespecífico.

1° round

PCR modificada para reduzir produtos não específicos.
Detecção de material em baixa quantidade na amostra.
2 rounds de reação com diferentes pares de primers.

Nested PCR

Produto específico e com maior concentração.

2° round

Produto inespecífico.

1° round

3'

5'

3'

5'

1º round com par de primers externos

3'

5'

3'

5'

2º round com par de primers internos

Variantes da PCR -- Nested PCR

Transcrição de RNA em DNA complementar (cDNA).
Utiliza RNA de fita simples como molde para sintetizar DNA de fita dupla.

RT-PCR

Associação da RT-PCR e PCR em uma só etapa

One-Step PCR

AAA RNA

AAA cDNA

primer

fita complementar

Transcrição reversa

Variantes da PCR -- RT-PCR e One-Step PCR

Transcrição de RNA em DNA complementar (cDNA).
Utiliza RNA de fita simples como molde para sintetizar DNA de fita dupla.

RT-PCR

Associação da RT-PCR e PCR em uma só etapa

One-Step PCR

AAA RNA

AAA cDNA

primer

fita complementar

Transcrição reversa

Variantes da PCR -- RT-PCR e One-Step PCR

Transcrição de RNA em DNA complementar (cDNA).
Utiliza RNA de fita simples como molde para sintetizar DNA de fita dupla.

RT-PCR

Associação da RT-PCR e PCR em uma só etapa

One-Step PCR

AAA RNA

AAA cDNA

primer

fita complementar

Transcrição reversa

Variantes da PCR -- RT-PCR e One-Step PCR

PCR + sistema de detecção de fluorescência em tempo real.
Detecção, quantificação e amplificação em uma única etapa.

PCR quantitativo (qPCR)

Componentes

Água livre de nucleases
Solução tampão
Nucleotídeos ---> dNTPs
Mg2+
Enzima DNA polimerase
Par de iniciadores ---> primers
Amostra de DNA

+

SONDA (PROBE) COM FLUORESCÊNCIA

Oligonucleotídeo marcado

CORANTE FLUORESCENTE

Intercalante de DNA de dupla fita

OU

Variantes da PCR -- qPCR

PCR + sistema de detecção de fluorescência em tempo real.
Detecção, quantificação e amplificação em uma única etapa.

qPCR

Componentes

Água livre de nucleases
Solução tampão
Nucleotídeos ---> dNTPs
Mg2+
Enzima DNA polimerase
Par de iniciadores ---> primers
Amostra de DNA

+

SONDA (PROBE) COM FLUORESCÊNCIA

Oligonucleotídeo marcado

CORANTE FLUORESCENTE

Intercalante de DNA de dupla fita

OU

Variantes da PCR -- qPCR

Detecção não específica.
Fluoróforo liga-se à DNA dupla fita e emite fluorescência.

Corante fluorescente - intercalante de DNA de dupla fita

F

Desnaturação

SYBR Green

F

Taq

Hibridização

Emissão de fluorescência

F

Taq

Extensão

Emissão de fluorescência

F

Emite fluorescência na presença do produto de PCR de interesse.
QUENCHER e REPORTER na mesma molécula: transferência de energia.
Permite multiplex.

Sonda (probe) - oligonucleotídeo marcado

5'

3'

5'

3'

5'

Q

R

5'

3'

5'

3'

5'

Q

R

Emissão de fluorescência

Variantes da PCR -- qPCR

Detecção não específica.
Fluoróforo liga-se à DNA dupla fita e emite fluorescência.

Corante fluorescente - intercalante de DNA de dupla fita

Emite fluorescência na presença do produto de PCR de interesse.
QUENCHER e REPORTER na mesma molécula: transferência de energia.
Permite multiplex.

Sonda (probe) - oligonucleotídeo marcado

5'

3'

5'

3'

5'

Q

R

5'

3'

5'

3'

5'

Q

R

Emissão de fluorescência

F

Desnaturação

SYBR Green

F

Taq

Hibridização

Emissão de fluorescência

F

Taq

Extensão

Emissão de fluorescência

F

Variantes da PCR -- qPCR

Variantes da PCR -- qPCR

Threshold

CT - ciclo onde a reação cruza o limiar de detecção (THRESHOLD)

Aquisição dos dados

Ciclagem

Variantes da PCR -- qPCR

Threshold

CT - ciclo onde a reação cruza o limiar de detecção (THRESHOLD)

Aquisição dos dados

Ciclagem

Variantes da PCR -- qPCR

Quantificação relativa

Quantificação absoluta

Uso de gene referência para determinar a concentração dos genes alvo

Ct dos genes;
ΔCt = subtração entre o Ct do gene e Ct da referência;
ΔΔCt = subtração entre ΔCt do grupo de estudo e ΔCt do grupo controle;
2^-(ΔΔCt) = 2 elevado ao negativo de ΔΔCt

Uso de curva padrão com concentrações conhecidas

Variantes da PCR -- qPCR

Quantificação relativa

Quantificação absoluta

Uso de gene referência para determinar a concentração dos genes alvo

Ct dos genes;
ΔCt = subtração entre o Ct do gene e Ct da referência;
ΔΔCt = subtração entre ΔCt do grupo de estudo e ΔCt do grupo controle;
2^-(ΔΔCt) = 2 elevado ao negativo de ΔΔCt

Uso de curva padrão com concentrações conhecidas

Multiplex qPCR

PCR + sistema de detecção de fluorescência em tempo real.
Detecção, quantificação e amplificação em uma única etapa.

Variantes da PCR -- Multiplex qPCR

Aplicações para o diagnóstico e estudo do HTLV

qPCR para carga proviral

One-Step PCR

Sequenciamento Sanger

Sequenciamento Sanger

Sequenciamento NGS -- MinION

Filtragem das sequências de boa qualidade

Separação das amostras de acordo com "código de barras"

Sequenciamento

Detecção do sinal em picograma

Aplicações para o diagnóstico e estudo do HTLV

Sequenciamento do HTLV

RT-PCR

PCR com primers externos

PCR com primers internos

Técnicas moleculares aplicadas à HTLV