Aluna: Laise de Moraes
Orientador: Ricardo Khouri

Coorientadora: Luciane Amorim

2021

Patogênese e virulência na infecção por CHIKV, DENV e ZIKV e aplicação de biologia de sistemas para identificação de marcadores de imunoativação e evolução viral

Introdução

Sobreposição do CHIKV, DENV e ZIKV no Brasil

MUSSO et al., 2015; ZHANG et al., 2016; COLOMBO et al., 2017; CAMPOS et al., 2018

febre

mialgia

exantema maculopapular

prurido

artragia

artrite

retro orbital

síndrome de Guillain-Barré

DENV quadros hemorrágicos

ZIKV síndrome congênita do zika

Introdução

Desafios para um bom diagnóstico diferencial

CHIKV alta morbidade e quadro crônico de artralgia e artrite

MUSSO et al., 2015; ZHANG et al., 2016; COLOMBO et al., 2017; CAMPOS et al., 2018

Reatividade cruzada para outros flavivírus

Técnicas padrão-outro laboriosas

Baixa sensibilidade de kits comerciais

Conservação das amostras

Introdução

Desafios para um bom diagnóstico diferencial

MUSSO et al., 2015; ZHANG et al., 2016; COLOMBO et al., 2017; CAMPOS et al., 2018

febre

mialgia

exantema maculopapular

prurido

artragia

artrite

retro orbital

síndrome de Guillain-Barré

DENV quadros hemorrágicos

ZIKV síndrome congênita do zika

CHIKV alta morbidade e quadro crônico de artralgia e artrite

Reatividade cruzada para outros flavivírus

Técnicas padrão-outro laboriosas

Baixa sensibilidade de kits comerciais

Conservação das amostras

alvos terapêuticos

antígenos candidatos para vacinas

biomarcadores

Existe uma assinatura biológica capaz de distinguir os casos de CHIKV, DENV e ZIKV.

Hipótese

Introdução

Biologia de sistemas

Objetivos

Integrar a diversidade genética viral, imunoativação e características clínicas da infecção aguda por CHIKV, DENV e ZIKV, aplicando a biologia de sistemas para prospecção de marcadores de diagnóstico e mecanismos de patogênese.

Realizar caracterização molecular dos isolados virais dos casos de infecções causadas por CHIKV, DENV e ZIKV;

Objetivos

Identificar diferenças na assinatura biológica entre as infecções causadas por CHIKV, DENV e ZIKV;

Objetivos

Identificar a interação da variabilidade genética viral, imunoativação e progressão da doença em indivíduos infectados por CHIKV, DENV e ZIKV.

Bahia

Ceará

Goiás

Piauí

Suspeita clínica para arbovirose n=342

Questionário com informações clínicas e demográficas

CHIKV n=109

DENV n=8

ZIKV n=32

Sadios n=9

Coleta de sangue total, saliva e urina

Recrutamento: 2016-2018

Métodos

Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos da UFBA: PArecer n° 1.657.324

Integração dos dados

Combinação de

modelo linear e não-linear

Árvore de agrupamento hierárquico

Rede Bayesiana

Métodos

Sequenciamento de genoma completo para CHIKV, DENV e ZIKV

MinION (Oxford Nanopore Technologies)

Protocolo: QUICK et al., 2017

Pipeline: BLACK et al., 2017

CHIKV = 109

ZIKV = 32

Quantificação de marcadores solúveis no plasma

Luminex 200 (MILLIPLEX)

Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel 29-Plex

Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II (SDF1a+b)

TGFb1 Magnetic Bead Single Plex

CHIKV = 54

ZIKV = 7

Sequenciamento de RNA total para avaliação da expressão gênica

NextSeq 500 (Illumina)

Estratégia paired-end com fragmentos de 75pb

CHIKV = 37

DENV = 8

ZIKV = 12

CONTROLES = 9

CHIKV n=42

ZIKV n=14

Objetivo 1)

Caracterização molecular dos isolados virais dos casos de infecções causadas por CHIKV, DENV e ZIKV

METADADOS DO SEQUENCIAMENTO

Download das sequências

CHIKV: n=5.038
ZIKV: n=1.816

Edição da árvore

FigTree v1.4.4

Avaliação do sinal temporal

TempEst v1.5.3

Seleção do modelo de substituição de nucleotídeos / reconstrução filogenética

IQ-TREE v1.6.12

ultrafast bootstrap de 1.000 réplicas

Filtragem dos dados

Tamanho: >7.000pb

Metadados: datação e local de isolamento

CHIKV: n=485
ZIKV: n=692

Alinhamento e edição

MAFFT v7.455

Aliview v1.26

CHIKV: n=130+42
ZIKV: n=206+14

CHIKV: n=485+42
ZIKV: n=692+14

CHIKV: Corr. coef.= 0,5006 / R²=0,2506
ZIKV: Corr. coef.=0,6120 / R²=0,3745

RECONSTRUÇÃO FILOGENÉTICA

Objetivo 1)

Caracterização molecular dos isolados virais dos casos de infecções causadas por CHIKV, DENV e ZIKV

KATOH; STANDLEY, 2013; KATOH et al., 2002; LARSSON et al., 2014; MINH et al., 2020; HOANG et al., 2018; KALYAANAMOORTHY et al., 2017; RAMBAUT, 2006;

Sumarização e edição da árvore

TreeAnnotator v1.10.5pre12

FigTree v1.4.4

Adobe Illustrator 2021

Configuração da análise

BEAUti v1.10.5pre12

Notepad++ v8.1.2

- Partição de códon: codificante e não codificante

- Modelo de substituição de nucleotídeos: HKY+G4

- Modelo de coalescência:

CHIKV: SkyGrid
ZIKV: SkyRide

- 500 milhões de réplicas (log a cada 100 mil) X 3

Corrida da reconstrução

BEAST v1.10.5pre12

Objetivo 1)

Caracterização molecular dos isolados virais dos casos de infecções causadas por CHIKV, DENV e ZIKV

RECONSTRUÇÃO FILOGEOGRÁFICA

RAMBAUT et al., 2016; SUCHARD et al., 2018; DRUMMOND; SUCHARD, 2010; DRUMMOND et al., 2006; GILL et al., 2013; MININ; SUCHARD, 2008; RAMBAULT et al., 2018; RAMBAULT, 2006

Objetivo 1)

Caracterização molecular dos isolados virais dos casos de infecções causadas por CHIKV, DENV e ZIKV

CHIKV:

Recente reintrodução na BA a partir do RJ (2016)

Migraçãodo vírus dentro da BA

Migração de Itabuna para Salvador e Maranguape (CE)

Objetivo 1)

Caracterização molecular dos isolados virais dos casos de infecções causadas por CHIKV, DENV e ZIKV

CHIKV:

Objetivo 1)

Caracterização molecular dos isolados virais dos casos de infecções causadas por CHIKV, DENV e ZIKV

ZIKV:

Objetivo 1)

Caracterização molecular dos isolados virais dos casos de infecções causadas por CHIKV, DENV e ZIKV

ZIKV:

Estudos prévios traziam que o Haiti possivelmente foi a fonte de migração do ZIKV no Brasil

Objetivo 1)

Caracterização molecular dos isolados virais dos casos de infecções causadas por CHIKV, DENV e ZIKV

ZIKV:

Nossos isolados contribuem para uma melhor resolução para reconstrução

Nordeste Brasil -> Haiti

Objetivo 1)

Caracterização molecular dos isolados virais dos casos de infecções causadas por CHIKV, DENV e ZIKV

ZIKV:

Objetivo 1)

Caracterização molecular dos isolados virais dos casos de infecções causadas por CHIKV, DENV e ZIKV

ZIKV:

Sem as 4 sequências

Com as 4 sequências

Objetivo 2)

Identificar diferenças na assinatura biológica entre as infeccções causadas por CHIKV, DENV e ZIKV

PIPELINE DO RNA-SEQ

Avaliação da qualidade do sequenciamento

FastQC v0.11.9

MultiQC v1.10.1

Análise de expressão diferencial

DESeq2 v3.13

Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN)

Contagem das leituras

FeatureCounts v2.0.1

Filtragem das leituras de baixa qualidade

Trimmomatic v0.39.1

Mapeamento com genoma humano

STAR v2.7.9

Referência: GRCh38.p13 (GENCODE)

ANDREWS, 2010; EWESL et al., 2016; BOLGER et al., 2014; DOBIN et al., 2012; LIAO et al., 2014; LOVE; HUBER; ANDERS, 2014; R DEVELOPEMENT CORE TEAM, 2018

O pipeline será depositado em um repositório

Etapa em andamento

Objetivo 2)

Identificar diferenças na assinatura biológica entre as infeccções causadas por CHIKV, DENV e ZIKV

Objetivo 2)

Identificar diferenças na assinatura biológica entre as infeccções causadas por CHIKV, DENV e ZIKV

TERMO GO - FUNÇÃO BIOLÓGICA

7 positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter
6 innate immune response
6 positive regulation of gene expression
6 regulation of transcription from RNA polymerase II promoter
5 response to cAMP
5 regulation of cell proliferation
5 negative regulation of angiogenesis
5 response to virus
5 immune response
4 regulation of cell cycle

Objetivo 2)

Identificar diferenças na assinatura biológica entre as infeccções causadas por CHIKV, DENV e ZIKV

TERMO GO - FUNÇÃO BIOLÓGICA

80 signal transduction
77 regulation of transcription from RNA polymerase II promoter
71 positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter
67 inflammatory response
55 innate immune response
47 immune response
45 apoptotic process
45 negative regulation of transcription from RNA polymerase II promoter
41 positive regulation of gene expression
41 positive regulation of cell proliferation

Objetivo 2)

Identificar diferenças na assinatura biológica entre as infeccções causadas por CHIKV, DENV e ZIKV

TERMO GO - FUNÇÃO BIOLÓGICA

19 nucleosome assembly
11 cell division
9 telomere organization
9 signal transduction
9 DNA replication-dependent nucleosome assembly
8 positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter
8 negative regulation of transcription, DNA-templated
8 antibacterial humoral response
8 regulation of transcription from RNA polymerase II promoter
8 mitotic cell cycle

Objetivo 2)

Identificar diferenças na assinatura biológica entre as infeccções causadas por CHIKV, DENV e ZIKV

TERMO GO - FUNÇÃO BIOLÓGICA

3 cell adhesion
2 platelet aggregation
2 cell division
2 response to toxic substance
2 spermatogenesis
1 sperm ejaculation
1 vasoconstriction
1 platelet activation
1 inflammatory response
1 angiogenesis

LUMINEX: CHIKV vs. ZIKV

Objetivo 2)

CHIKV

ZIKV

LUMINEX: CHIKV vs. ZIKV

Objetivo 2)

Estudo em andamento no Paraná (UTFPR) sobre associação do polimorfismo IL17A-197G<A ao risco de infecção por ZIKV

SDF-1α+β associado à recrutamento de células proinflamatória em artrite reumatóide

CHIKV

ZIKV

LUMINEX: CHIKV vs. ZIKV

Objetivo 2)

CHIKV

ZIKV

CTRL

LUMINEX: CHIKV vs. ZIKV

Objetivo 2)

CHIKV

ZIKV

CTRL

Objetivo 2)

LUMINEX: CHIKV RNA-SEQ

GENOMA COMPLETO

FRAGMENTOS

Objetivo 2)

LUMINEX: CHIKV RNA-SEQ

GENOMA COMPLETO

FRAGMENTOS

Eotaxina associada ao recrutamento de eosinófilos - rash cutâneo

Sex (female)

Hypertension

Edema

Retroocular pain

Age (>26y)

Recente introdução de CHIKV a partir do RJ (2016) e migrações sucessivas dentro do território da Bahia (interior <-> capital).

Foi possível diminuir as incertezas de local de migração e datação da disseminação do ZIKV no Brasil e nas Américas (Haiti).

Considerações finais

Diferenças no perfil de produção de IL-17A e SDF-1α+β entre indivíduos monoinfectados por CHIKV e ZIKV.

Recuperamos 16 genomas completos de CHIKV a partir do RNA-Seq, e para estes isolados, encontramos um perfil aumentado de Eotaxina, menor Ct e maior escore SHERA.

Perspectivas