Reação em Cadeira da Polimerase (PCR) -- Princípio e Componentes

Gerar múltiplas cópias de uma sequência específica de nucleotídeos de um determinado organismo, com alta sensibilidade e especificidade.

Princípio

Componentes

• Água livre de nucleases
• Solução tampão
• Nucleotídeos ---> dNTPs
• Mg2+
• Enzima DNA polimerase
• Par de iniciadores ---> primers
• Amostra de DNA

Reação em Cadeira da Polimerase (PCR) -- Princípio e Componentes

PCR Convencional -- Ciclagem e Amplificação Exponencial

Separação da dupla fita de DNA

Polimerização da fita complementar

Ligação do primer ao DNA

1.073.741.842

Após 30 ciclos

PCR Convencional -- Ciclagem e Amplificação Exponencial

amostra + loading dye

gel

tampão

cátodo

ânodo

DNA possui carga negativa

Migração do polo negativa (cátodo) para o polo positivo (ânodo)

O tamanho da molécula é proporcional à velocidade de migração

PCR Convencional -- Visualização em Gel de Agarose

Após revelação do gel...

PCR Convencional -- Visualização em Gel de Agarose

• PCR modificada para reduzir produtos não específicos.
• Detecção de material em baixa quantidade na amostra.
• 2 rounds de reação com diferentes pares de primers.

Nested PCR

Variantes da PCR -- Nested PCR

• Produto específico e com maior concentração.

2° round

• Produto inespecífico.

1° round

Variantes da PCR -- Nested PCR

• Transcrição de RNA em DNA complementar (cDNA).
• Utiliza RNA de fita simples como molde para sintetizar DNA de  fita dupla.

RT-PCR

Variantes da PCR -- RT-PCR e One-Step PCR

Variantes da PCR -- RT-PCR e One-Step PCR

Associação da RT-PCR e PCR em uma só etapa

One-Step PCR

Variantes da PCR -- RT-PCR e One-Step PCR

• PCR + sistema de detecção de fluorescência em tempo real.
• Detecção, quantificação e amplificação em uma única etapa.

PCR quantitativo (qPCR)

Variantes da PCR -- qPCR

Componentes

• Água livre de nucleases
• Solução tampão
• Nucleotídeos ---> dNTPs
• Mg2+
• Enzima DNA polimerase
• Par de iniciadores ---> primers
• Amostra de DNA

+

SONDA (PROBE) COM FLUORESCÊNCIA

Oligonucleotídeo marcado

CORANTE FLUORESCENTE

Intercalante de DNA de dupla fita

OU

Variantes da PCR -- qPCR

• Detecção não específica.
• Fluoróforo liga-se à DNA dupla fita e emite fluorescência.

Corante fluorescente - intercalante de DNA de dupla fita

Variantes da PCR -- qPCR

• Emite fluorescência na presença do produto de PCR de interesse.
• QUENCHER e REPORTER na mesma molécula: transferência de energia.
• Permite multiplex.

Sonda (probe) - oligonucleotídeo marcado

Variantes da PCR -- qPCR

Variantes da PCR -- qPCR

Variantes da PCR -- qPCR

Threshold

CT - ciclo onde a reação cruza o limiar de detecção (THRESHOLD)

Aquisição dos dados

Variantes da PCR -- qPCR

Uso de curva padrão com concentrações conhecidas

Variantes da PCR -- qPCR

Quantificação relativa

Uso de gene referência para determinar a concentração dos genes alvo

1. Ct dos genes;
2. ΔCt = subtração entre o Ct do gene e Ct da referência;
3. ΔΔCt = subtração entre ΔCt do grupo de estudo e ΔCt do grupo controle;
4. 2^-(ΔΔCt) = 2 elevado ao negativo de ΔΔCt

Multiplex qPCR

• PCR + sistema de detecção de fluorescência em tempo real.
• Detecção, quantificação e amplificação em uma única etapa.

Variantes da PCR -- Multiplex qPCR

Aplicações para o diagnóstico e estudo do HTLV

qPCR para carga proviral

One-Step PCR

Sequenciamento Sanger

Sequenciamento Sanger

Sequenciamento NGS -- MinION

Filtragem das sequências de boa qualidade

Separação das amostras de acordo com "código de barras"

Sequenciamento

Detecção do sinal em picograma

Aplicações para o diagnóstico e estudo do HTLV

Sequenciamento do HTLV

RT-PCR

PCR com primers externos

PCR com primers internos