Biologia Molecular:

Desenho de Primers para PCR

MSc. Laise de Moraes

VIII Simpósio de Biomedicina

2019

PCR

PCR

Princípio da técnica:

Gerar múltiplas cópias de uma sequência específica de nucleotídeos de um determinado organismo, com alta sensibilidade e especificidade.

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

PCR

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

1950            1960            1970            1980            1990

Estrutura da dupla hélice do DNA

Isolamento da bactéria Thermophilis aquaticus

Método enzimático de replicação in vitro de pequenas sequências de DNA

Taq polymerase a partir da enzima polimerase da bactéria Thermophilis aquaticus

Método de terminação de cadeia para sequenciamento de DNA (Sequenciamento Sanger)

Desenvolvimento da técnica PCR por Kary Mullis

Automação da PCR

Molécula do ano: Taq polymerase

Prêmio Nobel de Química: Kary Mullis

qPCR

NGS

Taq high fidelity polimerase

PCR Convencional

Componentes necessários:

- Água livre de nucleases

- Solução tampão

- Nucleotídeos ---> dNTPs

- Mg2+

- Enzima DNA polimerase

- Par de iniciadores ---> primers

- Amostra de DNA

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

PCR Convencional

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

- Água livre de nucleases

- Solução tampão

- Nucleotídeos ---> dNTPs

- Mg2+

- Enzima DNA polimerase

- Par de iniciadores ---> primers

- Amostra de DNA

Manutenção da concentração dos reagentes

Manutenção do volume final da reação

PCR Convencional

- Água livre de nucleases

- Solução tampão

- Nucleotídeos ---> dNTPs

- Mg2+

- Enzima DNA polimerase

- Par de iniciadores ---> primers

- Amostra de DNA

pH ótimo para a atividade da DNA polimerase

Íons, detergentes, proteínas estabilizantes e DTT

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

PCR Convencional

- Água livre de nucleases

- Solução tampão

- Nucleotídeos ---> dNTPs

- Mg2+

- Enzima DNA polimerase

- Par de iniciadores ---> primers

- Amostra de DNA

uso em concentrações iguais dos 4 dNTPs

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

PCR Convencional

- Água livre de nucleases

- Solução tampão

- Nucleotídeos ---> dNTPs

- Mg2+

- Enzima DNA polimerase

- Par de iniciadores ---> primers

- Amostra de DNA

co-fator da DNA polimerase

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

PCR Convencional

- Água livre de nucleases

- Solução tampão

- Nucleotídeos ---> dNTPs

- Mg2+

- Enzima DNA polimerase

- Par de iniciadores ---> primers

- Amostra de DNA

enzima termoestável isolada a partir da bactéria Thermus aquaticus

atividade enzimática ótima à 72°C, porém, permanece estável até 94°C

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

PCR Convencional

- Água livre de nucleases

- Solução tampão

- Nucleotídeos ---> dNTPs

- Mg2+

- Enzima DNA polimerase

- Par de iniciadores ---> primers

- Amostra de DNA

oligonucleotídeo sintetizado quimicamente com base na sequência já conhecida do DNA-alvo

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

PCR Convencional

- Água livre de nucleases

- Solução tampão

- Nucleotídeos ---> dNTPs

- Mg2+

- Enzima DNA polimerase

- Par de iniciadores ---> primers

- Amostra de DNA

DNA extraído para a obtenção do fragmento de interesse

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

PCR Convencional

Parâmetros de ciclagem:

"melting" ou desnaturação - separação da dupla fita de DNA ~ 1 minuto

"annealing" ou pareamento - ligação do primer ao DNA ~ 30 segundos

"extension" ou extensão - polimerização da fita complementar ~ 1 minuto

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

desnaturação inicial

desnaturação

pareamento

extensão

extensão final

hold

~94°C

~94°C

~52°C

~72°C

~72°C

4°C

30-40 ciclos

~24°C

início

~3 minutos

~1 minuto

~30 segundos

~1 minuto

~10 minutos

PCR Convencional

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

PCR Convencional

Visualização por Eletroforese:

- Baseia-se no fato da molécula de DNA possuir carga negativa

- O DNA migra do polo negativo (cátodo) para o polo positivo (ânodo)

- Tamanho da molécula proporcional à velocidade de migração

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

cuba de gel

vista lateral

amostra

gel

tampão

cátodo

ânodo

DNA

Eletroforese

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

Eletroforese

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

Otimização de PCR

Por que otimizar?

- Aumentar a eficiência/rendimento da reação (i.e. material para sequenciamento)

- Aumentar a especificidade (i.e. eliminar background, sombra dos primers

- Aumentar a reprodutibilidade

Quais parâmetros podem mudar?

- Concentração dos reagentes

- Componentes do tampão

- Condição dos ciclos

- Desenho dos primers

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

Desenho de primers

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

Qual a melhor região para escolher?

GGCGTCCGCTTTGAGTCCAAGATCGTGGACGGCGGCTGCTTTGCCCCATG

GGACCTCGAGGCCACTGGAGCCTGCATCTGCGAGATCCCCACTGATGTCT

CGTGCGAGGGCTTGGGGGCCTGGGTACCCACAGCCCCTTGCGCGCGCATC

TGGAATGGCACACAGCGCGCGTGCACCTTCTGGGCTGTCAACGCCTACTC

CTCTGGCGGGTACGCGCAGCTGGCCTCTTACTTCAACCCTGGCGGCAGCT

AGTTTCATACAGAGACTAGGACCGTCTGGCAACTCTCCGTAGCCGGCGTG

TCGTGCGATGTCACCACTGAACACCCGTTCTGCAACACGCCGCACGGACA

ACTCGAGGTCCAGGTCCCGCCCGACCCTGGGGACATGGTTGAGTACATTA

CTGCTCGCGGCTTGTGGGGGCCACGCCAGAGCGTCCCCGGCTGCGCCTGG

TCGACGCCGACGACCCCCTGCTGCGCACTGCCCCTGGGCCCGGCGAGGTG

Região de interesse

Região de hibridização para o primer FORWARD

Região de hibridização para o primer REVERSE

Comprimento ideal entre 17 a 28 pares de bases (pb)

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

3'-GGACCTCGAGGCCACTGGAGCCTGCATCTGCGAGATCCCCACTGATGTCTCGTGCGAGGGCTT
             |||||||||||||||||||||||||||||||||||

          5'-CGGTGACCTCGGACGTAGACGCTCTAGGGGTGACT-3'

3'-GGACCTCGAGGCCACTGGAGCCTGCATCTGCGAGGCCACTGGAGATGTCTCGTGCGAGGGCTT
             |||||||||               |||||||||
          5'-CGGTGACCT-3'         5'-CGGTGACCT

Primers muito longos são ineficiêntes na hibridização

Primers muito curtos perdem especificidade

Desenho de primers

Composição de bases deve ser entre 50 a 60% de G+C

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

C+G são ligações mais estáveis, isto porque são 3 ligações (ou pontes) de hidrogênio entre as bases

Desenho de primers

T+A são ligações menos estáveis, por conta da ligação "mais fraca" de 2 ligações (ou pontes) de hidrogênio

Primers devem terminar (3') em G ou C, CG, ou GC

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

Desenho de primers

3'-GGACCTCGAGGCCACTGGAGCCTGCATCTGCGAGATCCCCACTGATGTCTCGTGCGAGGGCTT
                  |||||||||||||||||

               5'-ACCTCGGACGTAGACGC-3'

3'-GGACCTCGAGGCCACTGGAGCCTGCATCTGCGAGATCCCCACTGATGTCTAAGCGAGGGCTT
                                      |||||||||||||||||

                                   5'-AGGGGTGACTACAGATT-3'

Temperatura de melting (Tm) deve ser entre 55 a 80°C

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

Desenho de primers

Tm = temperatura em que 50% dos primers estão hibridizados

Ta = temperatura para hibridização

Tm = 4(G +C) + 2(A + T) °C

Ta = Tm - 5°C

No caso do emprego de dois primers ou mais, as Tms devem ser compatíveis

Terminações não devem ser complementares

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

Desenho de primers

3'-TATCTAGGACCTTAAAGGG-5'

5'-GGGAA

3'-TATCTAGGACCTTA

como um grampo de cabelo

5'-GGGAA

3'-TATCTAGGACCTTA

HAIRPIN

Primers não devem ser autocomplementares

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

Desenho de primers

5'-GGGAAAATTCCAGGATCTAT-3'

3'-TATCTAGGACCTTAAAAGGG-5'

5'-GGGAAAATTCCAGGATCTAT-3'

3'-TATCTAGGACCTTAAAAGGG-5'

5'-GGGAAAATTCCAGGATCTAT-3'

SELF-DIMER

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

Desenho de primers

Primers não devem ser complementares entre si

PRIMER 1: 5'-AACTTGTACCTCCGTAAGC-3'

PRIMER-DIMER

PRIMER 2: 5'-TGGGATACAGTCGGA-3'

5'-AACTTGTACCTCCGTAAGC-3'

3'-AGGCTGACATAGGGT-5'

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

Desenho de primers

Primers não devem terminar com mais de 3 bases repetidas, especialmente em caso de G e C

5'-AACTTGTACCTAAGCCCC-3'

3'-TGACAGTCGGGGAAAGGGGAAAGGGGAAGGGGAAGGGGTAGG

DNA MOLDE

Regiões rica em guaninas

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

Desenho de primers

Nested PCR

Nested PCR

- PCR modificada para reduzir produtos não específicos

- Detecção de material em baixa quantidade na amostra

- 2 rounds de reação com diferentes pares* de primers

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

primer F

primer R

3'

5'

3'

5'

sequência alvo

3'

5'

3'

5'

1º round com par de primers "outer"

2º round com par de primers "inner"

sequência alvo

Nested PCR

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

1º round

- Produto inespecífico

2º round

- Produto específico

- Maior concentração

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

Desenho de primers

RT-PCR

RT-PCR

- Reverse transcription polymerase chain reaction

- Transcrição de RNA em cDNA (DNA complementar)

- Utiliza a RNA de fita simples como molde para sintetizar DNA de fita dupla

- Enzima transcriptase reversa

- cDNA + PCR em uma mesma reação: "One-Step"

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

AAA    RNA

AAA    cDNA

primer

fita complementar

transcrição reversa

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

Oligo (dT): se liga à cauda poli-A do mRNA

Se for um pool de mRNA é ideal para manter homogenea a conversão e posterior PCR

Qual primer usar se não é PCR usual?

Random primer: pequena sequência de 6 bases

Ideal para sintese de cDNAs pequenos e de RNA não poliadenilado

Primer específico: mais específico, pois tem relação com o alvo da reação

3

3

2

1

Para two-step utilizando primer específico, o cDNA é sintetizado com o primer forward

1

2

3

RT-PCR: primers

qPCR

qPCR

- Metodologia da PCR + sistema de detecção de fluorescência em tempo real

- Detecção, quantificação e amplificação de DNA em uma única etapa

- Agilidade para a obtenção de resultados

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

qPCR

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

SONDA (PROBE) COM FLUORESCÊNCIA

Oligonucleotídeo marcado

Componentes necessários:

- Água livre de nucleases

- Solução tampão

- Nucleotídeos ---> dNTPs

- Mg2++

- Enzima DNA polimerase

- Par de iniciadores ---> primers

- Amostra de DNA

CORANTE FLUORESCENTE

Intercalante de DNA de dupla fita

OU

+

qPCR

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

F

F

F

F

F

F

F

F

F

F

F

F

Taq

Taq

Desnaturação

Hibridização

Extensão

CORANTE FLUORESCENTE

Intercalante de DNA de dupla fita

- Detecção não específica

- Fluoróforo liga-se à DNA dupla fita e emite fluorescência

- Não permite multiplex

SYBR Green

Emissão de fluorescência

Emissão de fluorescência

qPCR

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

- Detecção específica

- Sonda marcada com fluorórofo altamente específico à sequência alvo somente emite fluorescência na presença do produto de PCR de interesse

- Permite multiplex

- Baseia-se na atividade 5'-3' exonuclease

- QUENCHER e REPORTER na mesma molécula: transferência de energia

SONDA (PROBE) COM FLUORESCÊNCIA

Oligonucleotídeo marcado

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

- Localiza-se de 1 a 5 pares de bases do primer

- Tm deve ser aproximadamente 10°C maior que a Tm dos primers

- A primeira base não pode ser G (QUENCHER)

- Não pode ter mais G do que C e não deve ter 4 bases consecutivas iguais

Q

R

REPORTER

QUENCHER

qPCR: sonda

qPCR

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

Q

R

5'

3'

5'

5'

3'

5'

3'

Q

R

5'

3'

5'

5'

3'

5'

3'

Q

R

5'

3'

5'

5'

3'

5'

SONDA (PROBE) COM FLUORESCÊNCIA

Oligonucleotídeo marcado

Primer F

Primer R

REPORTER

QUENCHER

Emissão de fluorescência

qPCR

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

Parâmetros de ciclagem:

Aquisição na qPCR

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

Threshold

CT - ciclo onde a reação cruza o limiar de detecção (THRESHOLD)

Baseline

(background)

Quantificação na qPCR

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

- Quantificação absoluta: utilização de curva padrão conhecida e com quantidades acuradas para interpolar com os resultados das amostras (carga viral para HIV-1)

- Quantificação comparativa: determinação matemática a partir de um ou mais genes controles (expressão gênica - quantas vezes mais expressa em reação à algo)

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

Desenho de primers

Multiplex PCR

Multiplex PCR

- Amplificação simultânea de dois ou mais DNA-alvos em apenas uma reação

- No caso de qPCR, cada alvo terá uma marcação fluorescente distinta

- Menor tempo, menor custo e diminui etapas de pipetagem

- Possibilidade de controle interno na mesma reação

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

Multiplex qPCR

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

Multiplex qPCR

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

Multiplex qPCR

sonda e equipamentos

Multiplex PCR convencional

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

Multiplex PCR convencional

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

Sequenciamento de genoma completo

- Estratégia para obtenção do genoma completo

- Aplicação de pools de primers para obter sobreposição de regiões

pool 1

pool 2

preparação da biblioteca de sequenciamento

material para sequenciamento

Multiplex PCR convencional

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

Sequenciamento de genoma completo

pool 1

pool 2

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

Desenho de primers

analise-primer

tutorial prático para estudar

https://github.com/lpmor22/analise-primer

Clone or download

dist

analise-primer.exe

Ferramentas para desenho de primer

Algumas ferramentas

- Primer3web (version 4.1.0)

http://primer3.ut.ee/

- Primer-BLAST

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

- Primer Design and Search Tool

http://bisearch.enzim.hu/?m=search

- PCR Primer Stats

http://www.bioinformatics.org/sms2/pcr_primer_stats.html

- Primal Scheme

http://primal.zibraproject.org

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

LT964969.1

KY704955.1

Biologia Molecular: Desenho de Primers para PCR

Desenho de primers

Biologia Molecular:

Desenho de Primers para PCR

MSc. Laise de Moraes

VIII Simpósio de Biomedicina

2019

www.slides.com/lpmor22

laise.moraes@fiocruz.br

@lpmor22